科學中文化_Beer's Law for protein concentration

剛剛在PTT Chemistry板上回答Beer's Law測protein concentration的問題:

基本上用Beer's Law來測蛋白質濃度大概都是依據這篇paper:

Gill, S.C. and von Hippel, P.H. 1989. Calculation of
protein extinction coefficients from amino acid
sequence data. Anal. Biochem. 182:319-326.



理論上,
因為蛋白質只有tryptophen、tyrosine、cystine(雙硫鍵)會有280nm吸收光
(phenylalanine吸260nm)

(最早的Ref:
Edelhoch, H. 1967. Spectroscopic determination of
tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry
6:1948-1954.)

所以我們可以用蛋白質序列中含有的Try, Tyr, Cys-Cys的數目，
推導出類似這樣的公式:

ε280 = (5500 × nTrp ) + (1490 × nTyr ) + (125 × nS-S )

這也就是所謂網路上查到的值
(最常用的database應該是Expasy的ProtParam
輸入蛋白質序列就會幫你算它的物化特性)

基本上因為這個公式是根據蛋白質序列的來預測extinction coefficient
所以在實際測量我們要測的蛋白質時，
理論就不需要再用標準品校正，
最需要校正的大概是spectrometer的靈敏度範圍跟buffer的背景值。

看到這邊應該大家都會覺得問題多多吧
沒錯，這個方法的其實簡化了很多實際上會存在的誤差
例如每個蛋白質的3D結構其實都會大大地影響吸光值
不過總括來說這個方法仍舊被認為是線性關係最廣跟再現性最好的方法
大概可以只有+-10%的誤差
其他常用的Lowry法、Bradford法的誤差跟蛋白質樣本選擇性更大
而且所謂的蛋白質標準品到頭來只是另一個已知濃度的不同蛋白質
(Lowry: copper-chelating)
(Bradford: Coomassie G250 binding)

至於有人說用ELISA來測定蛋白質濃度
那就只能用來測定已知的蛋白質
對於沒有抗體可用的蛋白質就不成立了
而且要建立一個測量特定蛋白質濃度的ELISA assay也是一個大工程

蛋白質這種macromolecule其實是蠻討厭的
因為太多結構上的因素要考量了
而且對於buffer又很挑剔
如何正確地/便宜地測定蛋白質濃度一直是一個挑戰
所以如果有人去聽任何生化的演講有講到用特定蛋白質濃度的實驗
(例如酵素動力學)
先問講者蛋白質濃度怎麼測定也是很基本(機車)的

當然，最後回到原po的問題
用Beer's Law還是蠻常見跟普遍可以接受的啦
要更精確大概要用放射線同位素標定吧

熱血科學家~!!!!